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激光共聚焦實驗的樣品準(zhǔn)備方法對比

更新時間:2016-05-05   更新時間:2016-05-05   點擊次數(shù):4495次

激光共聚焦實驗的樣品準(zhǔn)備方法對比

——無需細(xì)胞爬片的樣品準(zhǔn)備新方法 VS 傳統(tǒng)方法

 

    激光共聚焦顯微鏡可以觀察到細(xì)胞內(nèi)已經(jīng)標(biāo)記好的蛋白質(zhì)和分子,為生物學(xué)研究提供了更直觀的觀測方法。如今,激光共聚焦成像已經(jīng)是一個非常常規(guī)的實驗操作,應(yīng)用于生物學(xué)各個研究領(lǐng)域中。

  在細(xì)胞實驗中,如果要進行一次激光共聚焦成像,除了要知道相關(guān)的顯微鏡參數(shù)設(shè)置和操作以外,樣品的準(zhǔn)備也是非常重要的一環(huán)。

 

傳統(tǒng)方法

   由于激光共聚焦實驗對觀測耗材的底部有著比較高的要求,普通的培養(yǎng)皿,培養(yǎng)板或者培養(yǎng)瓶都不能直接用于激光共聚焦成像。

1.比較常用的是使用170μm左右厚度的蓋玻片作為激光共聚焦成像的細(xì)胞載體。但是使用蓋玻片,在實驗操作上是非常麻煩的,如果買的是國產(chǎn)的蓋玻片,首先要做的一步是將蓋玻片清洗并且烘干滅菌,才能開始使用。

2.進口的細(xì)胞爬片,雖然不需要清洗,但是還是需要進行包被才能讓細(xì)胞正常貼壁生長。通常是將處理好爬片直接放在多板中,然后鋪細(xì)胞,熒光染色后,再用鑷子將爬片拿出,反過來放在滴有封片劑(甘油配置)的載玻片上,再進行成像。如圖一所示:


圖一:使用蓋玻片和細(xì)胞爬片的做免疫熒光方法示意圖。

 

操作流程:

  1. 蓋玻片需用濃硫酸浸泡第二天,第二天用自來水沖洗20遍,置于無水乙醇中6小時,后用三蒸水沖洗3遍,再放在飯盒或玻璃培養(yǎng)皿中烘干,消毒,再烘干后放入超凈臺備用。
  2. 準(zhǔn)備好的蓋玻片或者專業(yè)的細(xì)胞爬片需要根據(jù)細(xì)胞的貼壁情況使用多聚賴氨酸等蛋白包被。
  3. 培養(yǎng)板中放置爬片非常有技巧,要將爬片與培養(yǎng)板底部緊密貼合,這樣才能避免長成雙層細(xì)胞。
  4. 常規(guī)免疫熒光操作后,取出爬片。準(zhǔn)備載玻片一張,在中間滴加適量的封片劑(甘油配置),將蓋玻片或爬片翻過來,蓋在封片劑上,再用指甲油封片進行成像。
  5. 在激光共聚焦成像之前,好用熒光顯微鏡檢查一下細(xì)胞狀態(tài)和成像效果,再去做激光共聚焦,畢竟做一次激光共聚焦的成像也不便宜的。

 

無需爬片的新方法

    這里要介紹的新方法,大大簡化了樣品準(zhǔn)備流程,需要用到專為共聚焦實驗設(shè)計的共聚焦培養(yǎng)皿,這里以德國ibidi的共聚焦培養(yǎng)皿為例(81156,德國ibidi)進行說明。共聚焦培養(yǎng)皿的底部是聚合物材質(zhì),具有親水表面,讓大多數(shù)種類的細(xì)胞可以直接貼壁,無需另外進行包被;同時,它們的底部符合蓋玻片標(biāo)準(zhǔn)——只有180µm的厚度,在折射率,阿貝系數(shù)上,它們的性能和標(biāo)準(zhǔn)爬片一致,再加上極低的自發(fā)熒光和細(xì)胞可以直接貼壁的特性,使它們成為共聚焦成像的培養(yǎng)皿。

  所有的操作在培養(yǎng)皿中進行,不再需要鑷子以及繁瑣的清洗,滅菌,包被程序(流程如圖二所示)

 

圖二:共聚焦培養(yǎng)皿的準(zhǔn)備樣品流程,可以直接進行細(xì)胞培養(yǎng)染色成像操作(圖中為德國ibidi 81156培養(yǎng)皿)

 

操作流程

  1. 在超凈臺中打開共聚焦培養(yǎng)皿的滅菌包裝,拿出培養(yǎng)皿,加入細(xì)胞懸液,蓋上皿蓋,放入培養(yǎng)箱中靜置,等待細(xì)胞貼壁。常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng),待細(xì)胞長置合適密度再取出,進行免疫熒光染色。
  2. 吸出培養(yǎng)基,以PBS清洗細(xì)胞,再用2%的多聚甲醛PBS溶液固定細(xì)胞。
  3. 20分鐘后,吸出固定液,加入0.1%Triton X-100
  4. 10分鐘后,吸出Triton,清洗細(xì)胞后加入BSA封閉。
  5. 加入抗體熒光染色后,吸出所有試劑,加入封片劑,可以開始共聚焦顯微成像。

 

   使用共聚焦培養(yǎng)皿還有個好處:往往一個共聚焦掃描成像持續(xù)時間很長,培養(yǎng)皿中的液體非常容易揮發(fā),共聚焦培養(yǎng)皿有皿蓋,可以減少揮發(fā);比如上述提到的ibidi共聚焦培養(yǎng)皿,有個巧妙的鎖扣設(shè)計,可以扣緊培養(yǎng)皿,保證在共聚焦成像的過程中,皿中的液體不會揮發(fā)(圖三)。

 

圖三:ibidi共聚焦培養(yǎng)皿的鎖扣設(shè)計

 

方法優(yōu)勢總結(jié)

1.一個培養(yǎng)皿完成細(xì)胞培養(yǎng)-染色-成像等系列操作,無需包被,無需爬片,操作簡便;

2.在培養(yǎng)皿里的操作對于操作技術(shù)的要求相對更低,也更便捷;

3.培養(yǎng)皿可使用皿蓋減少蒸發(fā),杜絕揮發(fā)對成像的影響。

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